技术文章您现在的位置:首页 > 技术文章 > 表面等离子共振传感器在生物检测中的应用
表面等离子共振传感器在生物检测中的应用
发布时间:2011-02-14   点击次数:3021次

 

项目名称:基于表面等离子共振原理的双光束检测技术与实验研究
 
1.       前言
   表面等离子体子共振(surface plasmon resonance,SPR)是一种物理光学现象[1]。光在玻璃界面处发生全内反射时的倏逝波可以引发金属表面的自由电子产生表面等离子波。在入射角或波长为某一适当值的条件下表面等离子波与倏逝波的频率和波数相等二者将发生共振入射光被吸收使反射光能量急剧下降在反射光谱上出现共振峰即反射强度zui低值。当紧靠在金属薄膜表面的介质折射率不同时,共振峰位置将不同。
表面等离子激元共振(SPR)的现象zui早于五十年代被预言。60年代Otto以及1971年Kretschmann分别发表了里程碑性质的文章,激发了人们应用SPR于传感机制的热情,而Kretschmann结构也为SPR型传感器奠定了基础。自1983年Liedberg[2]将其用于检测抗原体反应后,SPR以其具有的实时,原位及无损检测等优于其他生物检测技术的优势,引起了人们越来越浓的兴趣。
科学仪器是从事科学研究的物质手段。工欲善其事,必先利其器,以至科学研究之成败决定于探测实验方法和仪器。SPR技术自80年代初期引入到传感器界,发展十分迅猛。曾有人预测,基于SPR的免疫生物传感器是zui具有商品化潜力的一类传感器。这样的评价,一方面来源于对FET等传感器的技术困难的失望和畏惧,另一方面,是受到现代微电子工艺的支持以及廉价仪器就可以实现SPR检测的鼓舞。
如今,SPR传感器的理论分析、器件研制和实用系统开发日趋完善。由于SPR技术具有能实时监测反应动态过程、分析样品不需要纯化、生物样品无需标记、灵敏度较高、无背景干扰等特点,在生物科学领域应用中取得了长足进展。它以其优异的灵敏度、实时响应特性引起了科研人员和商业机构的广泛重视,被广泛用于环境监测、医疗、食品分析等[3],对于生物大分子相互作用机制分析,效果尤其显著,目前已成功地研制出各种类型的SPR免疫传感器。
生物分子学的发展,既为SPR型生物传感器提供了分子识别机制的基础,又提供了其应用的场所。与FET、热生物传感器、与SAW和酶电极技术相比,SPR以其高灵敏度、快速响应、试剂准备简单和操作简易而独树一帜。目前,基于SPR的生物传感器及系统已逐渐成熟,对其研究步入高峰期,在具有多样性和高灵敏度生物传感器的迫切需求下,开始全面从实验室走向市场,现在已经有一些商用仪器投入科研与医药事业中。其中zui为的是BIACORE系列产品。这些系统是在瑞典林平彻大学Liedberg等人的研究基础上,研制出可以用于基因序列分析、食品检测抗原抗体分析等方面的生化仪器,都是基于Kretschmann结构,采用专门的SPR系统和独立的微机相配合,软件控制液体流量、数据记录及SPR谱的分析,系统实时监测,可以连续数日工作,自动完成分析过程。但是价格高达几十万美元,不适合普遍使用。另外,Quantech、Texas Instruments和EBI等公司也都研制出了自己的SPR仪器系统。
2.       折射率测量
   SPR传感器有四种主要的检测方法:角度调制[4],波长调制[5],相位调制[6],强度调制[7]。其中,角度调制应用zui普遍,如今市场上的商用仪器多数采用角度调制的方法。
 采用角度调制测量时,入射光波长固定,反射光强度是入射角的函数,其中反射光强度zui低时所对应的入射角称为共振角。
SPR对附着在金属薄膜表面的介质折射率非常敏感,当表面介质的属性改变或者附着量改变时,共振角将发生变化。因此,SPR谱(共振角的变化vs时间)能够反映与金属膜表面接触的体系的变化。
如果在金属薄膜外侧加上一层待测物质,试样与金属薄膜的耦联影响了结构的折射率,从而影响了反射光、衰减波以及等离子体共振。所以,只要测得SPR谱,就可以得到样品折射率。若采用监控的方式,还可以实时反映样品溶液折射率的动态变化。
3.       生物传感器
SPR技术虽然可测得紧靠在金属薄膜表面介质层的光学常数。但是,进一步获得该介质的其他信息才是SPR研究的主要目的。例如通过膜厚估计成膜物质的结构排列,通过介质的折射率(n),膜厚度(d)和吸收系数(k)计算吸附物质的质量,进而求得相互作用生物大分子之间的键参数。
将普通的SPR传感器与生物分子互作技术(biomolecular interaction analysisBIA)[8]相结合,就可以制作全新的SPR生物传感器件。因为SPR光谱随金属表面的折射率变化而变化,而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比,因而可通过对生物反应过程中SPR光谱的动态变化获取生物分子相互作用的特异信号。这样,它就能在不需使用荧光或同位素标记甚至无须纯化各种生物组分的天然条件下,通过传感器芯片实时监测各类生物分子如多肽、蛋白质、寡核苷酸、寡聚糖、类脂甚至全病毒、细胞之间相互作用的整个过程,并通过分析软件获取生物分子结合/解离、亲和性/特异性、协同/拮抗、反应速率/浓度变化等互作动力学参数。
3.1生物分子互作技术(BIA
  生物分子相互作用是生命的基础, 而研究和分析生物分子相互作用的机理及分子结构与功能之间的关系, 对我们在分子水平上了解生物体系至关重要。 众所周知, 任何生物学方面的研究都可归结至生物分子相互作用的研究。近年来, 在分子水平上的功能研究技术大量涌现, 其中将表面等离子共振传感器与生物分子相互作用实时分析(BIA) 相结合的技术尤为引人注目。
生物分子相互作用分析是利用的生物传感技术对二个或二个以上的生物分子间作用进行实时监测,可测定的生物分子包括蛋白质、 多肽、核酸、多糖、磷脂及小分子如信号传导物、药物等。分析物无需纯化或溶于水,可在粗抽提液及附着于磷脂囊、病毒、细菌或真核细胞表面得以测定,与操作复杂、测量周期长传统检测技术相比,SPR生物传感器将测量过程变得方便快捷。
3.2 BIA 技术的基本原理
BIA 的测定原理是基于表面等离子共振监测传感片表面液体的折射率变化, 而这一变化和传感片表面所结合生物分子的质量成正比(图1)。因此可在非标记的情况下监测生物分子间的相互作用。
图1 SPR生物传感器图
当进行分子间相互作用分析时, 将其中一个反应物(称为配体) 偶联在传感片上, 含有另一个反应物(称作分析物) 的样品通过蠕动泵以恒定的流速通过传感片表面, 分子间有结合反应而导致传感片表面分子浓度的变化将由SPR 信号的改变而得到测定, 并以共振单位(RU) 作表达。以时间对共振单位(RU) 连续作图, 得到的传感图记录了整个反应过程包括结合和解离过程(图2)。当一轮反应结束后, 结合在传感片上的反应物可以用洗脱液洗脱, 从而使传感片得到再生进行下一轮反应。所以SPR生物传感器可重复使用多次。
图2:典型的感应图。加入的分析物与结合在传感片上的配体反应导致信号上升,记录复合物的结合过程和平衡状态。当样品加完后分析物被缓冲液代替, 此时信号的下降显示了解析过程。 从结合的量可反映出样品的浓度。
BIA 技术相对于其他分子间相互作用技术的优越性表现在:
²       通过控制配体的偶联,来调节各种不同样品, 不同目的的研究;
²       无需任何标记(即无需同位素, 酶标或荧光物的标记), 表明了BIA 可适用于研究任何形式的相互作用, 甚至无需进行样品的纯化;
²       在一个多聚物结合反应中, 每一步的相互作用都可分别记录下来。从而为研究反应机理提供新的空间;
²       实时分析,记录整个反应的结合与解析过程, 提供了反应的动态过程,测量周期短 这是其他技术无法比拟的。

3.2 典型应用
如今SPR生物传感器已广泛地用来分析生物分子相互作用的反应动力学、结合位点和反应物浓度等信息。对信号传导、免疫调节、蛋白工程、抗体定性、基因调控、核酸研究、及药物研制等方面的研究有很大的贡献。
3.2.1 确认结合对象
SPR生物传感器的一个主要应用领域是筛选和确认你感兴趣分子的结合对象(如: 从杂交瘤细胞培养液中鉴定单克隆抗体; 从天然物质粗提液或组合的物质文库中筛选新药物)。美国的Scheong-Plough制药公司[9]利用SPR技术发展出简便、决速、准确地筛选细胞因子桔抗物的方法。因为SPR生物传感器可在无标记的条件下实时地测定分子间的结合反应, 所以很快就能从粗提液中将感兴趣的生物分子鉴定出来。使用全自动型的SPR生物传感器,如Biacore公司的BIAcore 1000 或BIAcore 2000,可连续分析多达192个样品,节省大量的时间和劳力。如今已有不少生物制药公司用BIA 技术来进行药物筛选。
3.2.2 测定结合反应的动态参数[10]
  由于BIA 是一项实时分析技术,得到的传感图不仅可以看出结合反应,同时也记录了整个反应的动态信息,反应的强弱和快慢通常可从传感图的曲线上看出。配以合理的实验设计和数据分析方法,结合 BIA 技术,SPR生物传感器可测定反应的动态参数及亲和常数, 并以此来论证提出的反应机理是否正确。生物分子相互作用实时分析仪配有一整套数据分析软件来分析得到的数据,从而提供反应的途径和机理。
3.2.3 结构与功能关系分析
  SPR生物传感器可提供分子间相互作用的动态信息, 从而为生物分子的结构研究提供又一个极有价值的实验方法。例如通过监测蛋白质中单个氨基的改变对此蛋白质与其他分子结合功能的影响, 可探查出此蛋白质的功能基团和其重要性。 因为分子间的相互作用可在免标记及非纯化的条件下测定, 因此SPR传感器非常适合于研究生物分子由于不同的修饰而导致的功能变化。
4.       结语
  如今,SPR传感器已越来越受到学术界与工业界广大科学研究人员的青睐。相对于一些传统的方法, SPR传感器不仅能省样品而且能进行快速大量样品分析或筛选,它的zui大贡献表现在能提供其他方法无法得到的信息, 研究并回答以前无法回答的问题。尤其是SPR生物传感器的出现,加速了生命科学研究进展,使人们对复杂生命现象中的分子机理的理解更为深入并带来越来越多的新发现。可以说,SPR传感器就是解开复杂生命现象的钥匙。我们有理由相信,在未来的日子里,SPR传感器必有一个更为宽阔的发展前景。

 

河南农大迅捷测试技术有限公司

河南农大迅捷测试技术有限公司

工厂地址:河南省郑州市文化路农业大学14号楼一楼

主营产品:土壤肥料测试仪(土肥仪)、食品安全速测仪(农残仪)、化学发光分析仪、YN-XH型环保型消化仪、SPR生物分析仪等等

©2018 版权所有:河南农大迅捷测试技术有限公司  备案号:  总访问量:113345  站点地图  技术支持:化工仪器网  管理登陆

QQ在线客服
联系方式

18595839804

86-0371-63555867